آزمایشگاه آنالیز و روشهای دستگاهی

اسپكتروفتومتر ناحیه مریی Spectrophotometer

روشهای طیف سنجی براساس بر هم كنش تابش الكترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون امواج الكترومغناطیس، حاصل كاهش سرعت ذرات با بار الكتریكی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب افزایش سرعت ذرات می گردد. علاوه بر این انرژی نورانی در بر هم كنش با ماده و جذب آن توسط ماده، باعث برانگیختن ماده به ترازهای انرژی بالاتر می گردد. بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده بر هم كنش كرده و پدیده خاصی را سبب می گردد كه اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپكتروفتومتری را تشكیل می دهد.و می تواند شامل كلیه نواحی طیف الكترومغناطیس از اشعه گاما و ناحیه مریی تا امواج رادیویی باشد. در این رابطه، روشهای جذب، نشر، شكست، پراش (Diffraction) و پلاریزه شدن نور را می توان مورد توجه قرار داد كه مهمترین آنها روشهای اسپكتروفتومتری جذبی و نشری و فلورسانس است.

طول موج نور مریی بیشتر و در نتیجه انرژی آن كمتر از UV است. در اثر تابش نور به ماده در آن نقل و انتقالات الكترونی صورت می گیرد، e ها تحریك شده و به سطوح انرژی بالاتر می روند. بسته به ساختمان شیمیایی جسم، نقل و انتقالات الكترونی مختلفی می تواند صورت گیرد، و محل جذب بستگی به ساختمان شیمیایی ماده دارد. بنابراین از g_max برای شناسایی مواد استفاده می شود كه طول موجی است كه در آن حداكثر جذب صورت می گیرد و برای تعیین غلظت جسم مجهول g_max  را به نمونه می تابانیم. مقدار جذب از قوانین جذب Bear & Lambert پیروی می كند و از رابطه A=e lc محاسبه می شود.

معمولا در محدوده ای كه جذب با غلظت رابطه خطی دارد ،تعیین مقدار انجام می شود.اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزدیك باشد و غلظتها هم در محدوده خطی باشند، می توان با استفاده از تناسب  محاسبات را انجام داد.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپكتروسكوپ

اسپكتروفتومتر از دو بخش اسپكترومتر و فتومتر تشكیل شده است. اسپكترومتر بخشی است كه نور منوكروم را ایجاد كرده و دارای منبع نور، عدسی، شكافها، منوكروماتور (صافی، منشور یا ((Grating system) می باشد. بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد.

1- منبع نورانی:منبع نور مورد استفاده در اسپكتروفتومتر بسته به ناحیه مورد استفاده، متفاوت می باشد. برای نورهای مرئی از لامپ تنگستن استفاده می شود كه نورهایی با طول موج بین 350 تا 800 نانومتر ایجاد می كند. و برای نورهای ماوراء بنفش (UV) از لامپ جیوه، هیدروژن استفاده می شود. این لامپها در ناحیه بین 200 تا 600 نانومتر بكار می روند. در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع لامپ وجود دارد.

2- عدسی ها: (آینه ها): برای كنترل كردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است. به جای عدسی ها از آینه هایی كه به شكل نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود.

3- شكافها (slits): در هر اسپكتروفتومتری دو شكاف وجود دارد: یكی را شكاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند. شكافها رل مهمی در جداكردن نور دلخواه با طول موج مشخص دارند. به همین جهت اندازه این شكافها بسیار مهم هستند. بیشتر دستگاهها پیچی دارند كه اندازه این شكافها را می توان برحسب احتیاج تغییر داد. هر چه طول این شكافها بیشتر باشد پهنای نور عبوری (band-pass) بیشتر بوده و دامنه طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری كه مورد نیاز نیستند عبور می كنند. این نور اضافی را Stray light می نامند

4- منوكروماتور(monochromators): اشعه نورانی پس از عبور از عدسی ها و شكاف مقدار و مسیر آنها كنترل شده سپس به دستگاهی كه می تواند نور پلی كروم را به منوكروم تبدیل كند وارد می شود. پس نوری با طول موج مشخص و انتخابی به وجود می آورند. دو نوع منوكروماتور وجود دارد منشور و Grating.

5- محل نمونه:ظرف محتوی نمونه را سل یا كووت (cuvett) می نامند كه از جنس شیشه، كوارتز یا پلاستیك است. برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بلانک بكار می رود. سلهای شیشه ای و پلاستیكی برای ناحیه مرئی به كار می رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل كوارتز استفاده می شود. طول سلها معمولا 1 سانتی متر است و سلهایی با طول cm 1/0 تا cm 10 نیز موجود می باشد. محل قرار گرفتن نمونه بسته به اینكه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بلانك) دارد یا نه، Single beam و Double beam نام دارد. و كووت ها برحسب نوع شیشه و شكل چند نوع می باشند.

1- كووتهای مكعبی: سطح مقطع این كووت ها مربع بوده و از جنس شیشه خالص (برای نورهای مرئی) و كوارتز( برای نور ماوراء بنفش) می باشند. شیشه نور مرئی را از خود عبور می دهد ولی نور ماوراء بنفش را به مقدار زیادی جذب می كند. كووتهای مكعب، گران و كاركردن و تمیز نگهداشتن آنها دقت بسیار لازم دارد.

2- كووتهای گرد: سطح مقطع این دسته از كووتها گرد بوده و برای كارهای روزمره آزمایشگاهی بكار می روند. با همه دقتی كه در ساختن كووتها می شود ،مكرر دیده می شود كه آیا A دو كووت مشابه، یكسان نیست. برای جلوگیری از استفاده كووتهای ناجور باید آنها را كالیبره نمود.

برای كالیبره كردن كووتها محلولی را كه نسبتا پایدار است مثل هموگلوبین با غلظت 50 میلی گرم درصد میلی لیتر تهیه می نمایند. باید T این محلول در طول موج nm 540 برابر 3/0 ± 50% باشد. راه دیگراینست كه به جای كالیبره كردن كووتها از یك كووت برای شاهد و استانداردو نمونه استفاده كنند.

نكات زیر را باید درباره كووت ها رعایت كرد:

1- هرگز قسمت پایین كووت را با دست نمی گیرند چون نور از این قسمت كووت عبور می كند.

2- كووت را دو بار با محلول مورد آزمایش آبكشی می نمایند.

3- موقع استفاده از كووت ها آنها را با پارچه نرمی كه پرز ندهد پاك می كنند در صورت امكان از كاغذهای مخصوص پاك كردن عدسی استفاده می نمایند.

4- محلول داخل كووت باید عاری از حباب هوا باشد.

5- كووت را طوری در اسپكتروفتومتر قرار می دهند كه علامت مخصوص روی كووت به طرف خواننده باشد.

6- معمولا از همان مسیری كه كووت را در اسپكتروفتومتر قرار داده اند از همان مسیر هم آن را خارج می كنند.

7- وقتی از دستگاه استفاده نمی شود دریچه روی محفظه كووت را می بندند.

8- كووتها را با محلول تمیز كننده قوی نمی شویند. حتی در محلولهای ضعیف نیز به مدت طولانی قرار نمی دهند.

9- در صورت اجبار داخل كووت را با سوآپ پنبه ای تمیز می كنند.

10- از كووتهای كالیبره نشده استفاده نمی كنند.

11- باید اندازه كووت و حجم محلول اندازه گیری مناسب باشد..

6- دتكتور (نور سنج): نور پس از عبور از عدسیها و شكافها و منوكروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می رود. اسباب منوكروماتور، نور دلخواه و با طول موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند. رنگ این نور مكمل رنگ محلول است. اگر رنگ محلول سبز- آبی (مثل تعیین مقدار گلوكز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج nm  495-475 باشد رنگ فیلتر- منشور یا گریتینگ باید نارنجی یا نزدیك آن با طول موج بین nm 620-600 باشد. چون رنگهای نارنجی مكملش سبز-آبی است. بنابراین وقتی منوكروماتور رنگ مكمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی كه در لوله وجود داشته و بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ،جذب شده و بقیه آن به نورسنج می رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الكتریكی قادر است كه مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید. دتكتورها شامل انواع فتوشیمیائی، فتوالكتریكی و حرارتی می باشد كه در ناحیه مرئی و ماوراء بنفش از دتكتورهای فتوالكتریكی مانند فتوولتتیك و فتوتیوب و فتومولتی پلایر تیوب استفاده می شود.